Egyházzenei darabjainak legnagyobb gyűjteményét Monteverdi 1610-ben publikálta Sanctissimae Virginis missa ac Vesparea cum nonnullis sacris concentibus címen. A kötetet V. Pál pápának ajánlotta. A Missa In illo tempore hatszólamú kompozíciója basso continuo kísérettel készült, de még sok tekintetben a 16. századi vokális polifóniát idézte. A Mária-vesperások már vegyes stílust tükröznek. A vesperás zsoltárok között az antifóniák helyét egy-háromszólamú motetták vették át, a dallamok nagy része gregorián eredetű, ezek feldolgozása azonban az ellenpont-technikára és cantus firmusra épít. A művekben megjelennek Monteverdi új stílusának jellegzetességei is: monodikus és koncertáló szakaszok, hangszeres ritornellek, ostinatók, kettős kórus, visszhang-effektusok stb. Ezek a megoldások a szerző egyházzenéjét is az operához közelítették. Olybá tűnik, minthogyha Monteverdi tudatosan haladt volna a madrigáltól és az egyházi daraboktól az operaműfaj felé.